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      葡萄糖含量試劑盒說明書(測組織、細(xì)菌或細(xì)胞) 微量法
      點擊次數(shù):1763 更新時間:2019-10-23

                                                                 規(guī)格:100管/96樣

      葡萄糖含量試劑盒說明書(測組織、細(xì)菌或細(xì)胞)

      微量法

      正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

      測定意義:

      葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物,而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動物而言,葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組

      織等的唯yi能源,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。

      測定原理:

      葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并產(chǎn)生過氧化氫;過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。

      需自備的儀器和用品:

      可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水

      試劑的組成和配制:

      試劑一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

      試劑二:液體 10ml×1 瓶,4℃保存;

      試劑三:液體 10ml×1 瓶,4℃保存;

      葡萄糖提取:

      1、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),研磨成勻漿,95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心10min,取上清液備用。

      2、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復(fù)30次),95℃水浴10分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。

      測定步驟:

      1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至505nm,蒸餾水調(diào)零。

      2、混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合,用多少配多少。

      3、加樣表(在EP管或96孔板中加入下列試劑):

      試劑(μL)

      空白管

      標(biāo)準(zhǔn)管

      測定管

      樣本

       

       

      20

      試劑一

       

      20

       

      蒸餾水

      20

       

       

      混合試劑

      180

      180

      180

      混勻,置 37℃(哺乳動物)或 25'C(其它物種)保溫 15min 后,于 505nm 波長處讀取吸光

      度。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3??瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

      葡萄糖含量計算:

      1、按樣本蛋白濃度計算

      葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)

      =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。

      2、按樣本鮮重計算

      葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

      =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W

      3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

      葡萄糖含量(µmol/104cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)

      =0.001×(A3-A1)÷(A2-A1)

      C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5µmol/mL;V1:加入樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1mL;

      Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

      注意:低檢測限為 50nmol/g  鮮重或 0.5nmol/mg prot

       

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