A549+luc人肺癌細(xì)胞+luc

Human lung cancer cells ,A549 luc

貨號(hào)：YJ-h011a（STR（A549鑒定））

價(jià)格： 3200.0

規(guī)格： 5*10 ⁵

細(xì)胞介紹

該細(xì)胞系由D.J.Griad通過(guò)肺癌組織移植培養(yǎng)建系，患者為58歲白人男性。A549能通過(guò)胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。

該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：肺癌          

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，多角形；貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10⁶ 細(xì)胞數(shù)        

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

細(xì)胞篩選

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其Luc熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。        

建議收到細(xì)胞后至少傳3代，凍存留種后再進(jìn)行篩選。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí)，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無(wú)細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過(guò)程中，漂浮細(xì)胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟：

1.  轉(zhuǎn)染 （1）將A549細(xì)胞接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè)，

（2）第二天，細(xì)胞融合度為50%左右時(shí)用于病毒轉(zhuǎn)染，

（3）加入1mL完全培養(yǎng)基，再加20 μL Luciferase過(guò)表達(dá)慢病毒，

（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，

（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基，

（6）當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。

2.  篩選：用嘌呤霉素4ug/mL抗性篩選6周，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞記作A549+Luc。

3. 體外熒光素酶活性檢測(cè)

取A549細(xì)胞消化，離心，棄上清，加20μL細(xì)胞裂解液，再加100μL熒光素酶底物，檢測(cè)發(fā)光情況。

結(jié)果表明慢病毒感染A549細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K（推薦YJ-0007）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

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