流式細胞術實驗操作步驟

流式細胞技術（Flow cytometry, FCM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物，它能有效地從單細胞水平區分異質性細胞群體，檢測對象包括但不限于懸浮細胞、貼壁細胞或從實體組織分離的單細胞懸液和其他生物顆粒。

一、細胞表面染色步驟

1.細胞準備：

1.1 采集全血或組織（脾，淋巴結，胸腺和骨髓等），用細胞染色buffer（或PBS）制成單細胞懸液。對于體外刺激的細胞，直接將刺激后的細胞懸浮在細胞染色buffer（或PBS）中，然后進行第2步。

1.2 加滿細胞染色buffer（或PBS）, 1000 rpm 離心細胞懸液5分鐘，棄掉上清。

2. 紅細胞裂解：

2.1 如果需要裂解紅細胞（如脾臟），將10×紅細胞裂解液（RBC）用H2O稀釋到1×，放置到室溫。將細胞重懸于3 mL 1 × RBC中，室溫孵育5分鐘。

2.2 加入10 mL細胞染色buffer（或PBS）終止紅細胞裂解，1000 rpm離心細胞懸液5分鐘，棄掉上清。

2.3 重復洗滌一次，同步驟1.2。

2.4 細胞計數，用細胞染色buffer（或PBS）將細胞制成1×107 /mL懸液。將100 μL細胞懸液加入流式管中備用。

3. 封閉Fc受體：

        封閉Fc受體能減少染色過程中的非特異性染色。小鼠中，純化的CD16/CD32單抗能和FcγRⅢ/Ⅱ結合，封閉非特異性染色，可加入5-10 μg/mL的Anti-Mouse CD16/32單抗100 μL，冰上孵育10分鐘。對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig或者血清進行阻斷。

4. 細胞染色：

4.1 按照說明書的推薦用量加入熒光標記的抗體，混勻后置于冰上，避光孵育30分鐘。

4.2 加入5 mL FACs buffer (或PBS) 重懸細胞，1000 rpm離心細胞懸液5分鐘，棄掉上清。

4.3 加入0.5 mL FACs buffer(或PBS)重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測和分析。

注意事項

1. 在抗體使用之前，快速離心一下，使之聚集到管的底部。

2. 熒光標記的抗體應該避光4℃保存，不要冷凍。

3. 當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果，染色后應該馬上分析。

二、細胞內細胞因子染色步驟

1. 細胞準備：

1.1 收集細胞，用細胞染色buffer（或PBS）制成單細胞懸液，調整細胞濃度約為1 × 107/mL。

1.2  如需裂解紅細胞，將紅細胞裂解液(RBC)稀釋至1×，并平衡至室溫，用適量的1×紅細胞裂解液將細胞懸起，室溫避光孵育10分鐘；加入細胞染色buffer（或PBS）終止裂解，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。加入細胞染色buffer（或PBS）重復洗滌一次，調整細胞濃度約為1 × 107/mL。

1.3 取100 μL細胞/管（約1 × 106細胞），分別加到已經標記好的流式管底部。

2. 固定：

2.1 如需要表面染色，則依照“細胞表面染色步驟"選用適宜抗體進行表面染色。然后用稀釋至1×的細胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），將流式管中的細胞懸起，室溫避光孵育30分鐘。

2.2 1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

3. 破膜：

3.1 用稀釋至1×細胞破膜buffer將固定過的細胞懸起，1000 rpm離心力離心5分鐘，棄去上清。

3.2 重復洗一次，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

3.3 加入1 mL 1×細胞破膜buffer，4℃避光孵育30分鐘；1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4. 胞內染色：

4.1 用100 μL 1×細胞破膜buffer重懸細胞，加入相應的抗體，混勻，4℃避光孵育至少30分鐘。

4.2 加入2 mL 1×細胞破膜buffer懸起細胞，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4.3 加入2 mL細胞染色buffer（或PBS）懸起細胞，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4.4 加入0.5 mL細胞染色buffer（或PBS）重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測和分析。

注意事項

1. 同一個細胞同時做細胞表面和細胞內的蛋白，建議先做細胞表面染色，再固定、破膜。

2. 細胞內染色推薦使用同型對照。

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