黃曲霉素(AFT)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

              試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。 

 聲明：應(yīng)國家相關(guān)部門關(guān)于違禁字的規(guī)定本文中黃曲霉堵素中的毒以堵替代

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中總黃曲霉堵素(AFT)殘留的定量檢測。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用直接競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有黃曲霉素偶聯(lián)抗原，加入黃曲霉堵素(AFT)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離黃曲霉堵素(AFT)與微孔條上預(yù)包被的黃曲霉堵素(AFT)偶聯(lián)抗原互相競爭抗黃曲霉堵素(AFT)抗體酶標(biāo)記物，用 TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中黃曲霉堵素(AFT)含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃曲霉堵素(AFT)的含量。

3 試劑盒組成

• 預(yù)包被的 AFT 偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×4 條）。

• AFT 標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7ng/ml,8.1 ng/ml。

抗 AFT 抗體酶結(jié)合物：1 瓶（3ml）。

顯色液 A：1 瓶（3ml）。

顯色液 B：1 瓶（3ml）。

終止液：1 瓶（3ml），2M 硫酸。

樣本稀釋液：1 瓶（10×,  3ml），用于樣品稀釋用。

濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

說明書一份。

4 需要而未提供的材料

4.1 設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。4.1.2粉碎機(jī)。4.1.3量筒。4.1.4振蕩器。4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。

4.1.7微量移液器。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5 貯存

試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6 注意事項(xiàng)

使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。

不要使用過期試劑盒。

試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。

標(biāo)準(zhǔn)品中含有黃曲霉素，使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。

終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗(yàn)結(jié)果。

不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。

7 工作液準(zhǔn)備

• AFT標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml
• 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
• 樣本稀釋液：備用
• 顯色劑：已備用，避免光線直照
• 反應(yīng)終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25µl處理后的樣品，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實(shí)驗(yàn)須知

• 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。
• 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
• 請不要改變分析程序
• 請使用精確的微量移液器
• 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
• ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作
• 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

• 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2 分析步驟

• 預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測
• 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
• 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
• 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
• 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50µl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
• 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
• 在所有孔中加入50µl的抗黃曲霉素B1抗體酶結(jié)合物
• 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液

體。

9.4 反應(yīng)

• 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻
• 37℃溫浴10min
• 每孔中加入50µl終止液，混勻
• 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
• 結(jié)果計(jì)算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以黃曲霉素B1濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為AFT濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中AFT濃度C（ng/ml）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

• 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)黃曲霉素B1 100% 黃曲霉素B2 80% 黃曲霉素G1 75% 黃曲霉素G2 30%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.1ppb B0吸光度*值應(yīng)大于1.0試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。

13試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ng/ml~8.1ng/ml。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。